一、实验目的

用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。

二、实验原理

1.牛津杯法

2.纸片扩散法（K-B法）

3.二倍稀释法

在抑菌实验中，为了评判某种药物的抗菌功效，最低抑菌浓度（MIC）是非常重要的指标，利用二倍稀释法可以得到MIC值。凡能抑制试验菌生长的最高药物稀释度为该药的最低抑菌浓度（MIC）。
将待检药物先以合适的液体培养基在试管或96孔板内进行连续稀释，每管内再加入一定量实验菌液，培养后，观察细菌生长情况，与空白对照比较，以肉眼观察培养基清亮且未见细菌生长的最低浓度判定为该药物的最低抑菌浓度。将无细菌生长的药物和菌种划线接种到新的琼脂平板上进行培养，进一步确定该药物的MIC。通常每菌重复3次，求平均值。

三、实验方法及步骤（纸片扩散法）

0.准备加药处理的滤纸圆片，取一定量的药品加在我们的滤纸圆片上面，然后将其放在一个干净的细菌板中待用。

1.测定菌液的浊度，从而统一菌液的浓度。我们就是从摇的菌液中取一些母液和用PBS进行稀释，然后拿到浊度仪进行浊度检测，是浊度Macfarland达到0.5或者OD 0.2（但是这个不一定），这样做的目的就是使菌液的浓度达到10⁸ CFU/ML

2.用棉花棒进行涂抹，用100ul的移液枪取90ul的菌液，这个和之后用棉棒涂的步骤之间的时间间隔尽量少一些，不然容易挥发。用棉棒进行涂抹的时候，注意就是棉棒需要提前沾一下菌液，不然棉棒直接进行涂抹很容易将我们的培养基戳破，所以需要沾一下，但是注意也不是说沾了就行，沾完以后还需要在瓶口内壁充分进行挤压到不滴水，然后用这个涂布棒将所有这个菌液的板子都涂完。

3.涂菌方法：棉花棒倾斜拿，然后就像涂水彩画一样一条压一条地涂在平板上，涂完以后再旋转60℃，然后再涂一次，然后再多进行几次，这样就能涂抹均匀。

4.将我们一开始处理好的添加药品的滤纸圆片加在涂抹菌液的固体培养基上面。

四、实验方法（牛津杯法）

note：牛津杯法的原理和纸片扩散法的原理差不多，纸片承载的药物的量可能不是很多就是一般是30——40ul的量，但是牛津杯法的话，可以承载药物的量就是200ul。

1.取培养的菌液放到15ml的管子中进行粗稀释，然后转移稀释后的液体到浊度瓶中进行浊度测定以确定我们细胞的量。直至浊度介于0.5左右，然后以15ml管子中的菌液作为涂板液。

2.用棉花棒进行涂抹，用100ul的移液枪取90ul的菌液，这个和之后用棉棒涂的步骤之间的时间间隔尽量少一些，不然容易挥发。用棉棒进行涂抹的时候，注意就是棉棒需要提前沾一下菌液，不然棉棒直接进行涂抹很容易将我们的培养基戳破，所以需要沾一下，但是注意也不是说沾了就行，沾完以后还需要在瓶口内壁充分进行挤压到不滴水，然后用这个涂布棒将所有这个菌液的板子都涂完。

3.然后将牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10 mm,牛津杯一般可以装240ul，我们这里装的是200ul的体积)放到涂好菌液的板子上，往牛津杯中加入200ul的药物。

4.加满后培养基正面向上置37℃培养16-18小时，观察结果，抑菌圈用尺直接量就可以。在培养中,一方面试验菌开始生长，另一方面抗生素呈球面扩散，离杯越近，抗生素浓度越大，离杯越远抗生素浓度越小。随着抗生素浓度减小，有一条最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈，这就叫“抑菌圈”。抗生素浓度越高，抑菌圈越大。

细菌、真菌等，特别是那些