010 基因克隆实验

诺唯赞的高保真酶

艾科瑞高保真酶

一、质粒的转化

①37℃预热带有氨苄抗性的LB固体培养基；
②取出一管（100ul）感受态，冰上融化，连接体系同时冰浴，如果是我们的质粒冰上化开；
③加入5ul的连接体系或者1ul的质粒，轻轻弹匀以后放置在冰上30min；
④42℃金属浴热激90秒，迅速放回冰上，静置2——3分钟；
⑤将上述液体转入900ul的SOC培养基（或者就正常的没有加抗性的LB培养基），摇床37℃，培养1h，转化质粒培养30min；
⑥12000rpm，离心10s，弃去上清加入1ml的无菌水重悬细菌；
⑦12000rpm，留取100ul上清重悬细菌，并涂板，37℃，培养13——16小时。
⑥——⑦步骤我们是直接8000rpm，离心10s，然后就留100ul的LB培养基重悬细菌，然后就涂板了。

常规转化流程

取100 µL冰上融化的感受态细胞，加入目的DNA（质粒或连接产物），轻轻混匀（轻柔吹打或轻弹管壁数下），冰上静置30 min。
42°C水浴热激45~60 s，迅速转移至冰浴中，静置2 min(冰上静置过程中请勿晃动样品，否则会降低转化效率)。
向离心管中加入700 µL不含抗生素的无菌液体培养基（SOB或LB），混匀后37°C，200 rpm复苏60 min。
根据实验需要，取合适体积的复苏液均匀涂布到含相应抗生素的SOB或LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

快速转化流程
A. Amp抗性质粒

取100 µL冰上融化的感受态细胞，加入目的DNA（质粒或连接产物），轻轻混匀（轻柔吹打或轻弹管壁数下），冰上静置5 min。
42℃水浴热激45~60 s，迅速转移至冰浴中，静置2 min(冰上静置过程中请勿晃动样品，否则会降低转化效率)。
向离心管中加入700 µL不含抗生素的无菌液体培养基（ SOB或LB），取合适体积的复苏液均匀涂布到含Amp抗生素培养基上，或不加培养液直接涂布，37°C培养箱倒置培养过夜。
B. Kana抗性质粒
取100 µL冰上融化的感受态细胞，加入目的DNA（质粒或连接产物），轻02
42°C水浴热激45~60 s，迅速转移至冰浴中，静置 2 min(冰上静置过程中请勿晃动样品，否则会降低转化效率)。
向离心管中加入700 µL不含抗生素的无菌液体培养基（SOB或LB），混匀后37°C，200 rpm复苏20 min (复苏时间每增加5 min转化效率提高3~5倍)。
取合适体积的复苏液均匀涂布到含Kana抗生素培养基上，37°C培养箱倒置培养过夜。
附：Kana抗性的质粒快速转化流程必须增加复苏这一步骤，这是由于Amp抗生素和Kana抗生素的作用机理不同。Amp抗生素阻止细菌细胞壁的合成以抑制细菌生长，但不影响Amp抗性基因的表达，抗性基因表达产物降解Amp抗生素后细菌正常生长扩繁；Kana抗生素能与细菌30S核糖体结合从而使mRNA密码误读，Kana抗性基因无法表达，抗生素不被降解，细菌无法生长。因此Kana抗性质粒的转化必须增加复苏步骤，使细菌细胞内积累一定量的抗性基因表达产物。

抗生素的板子虽然被紫外照射了半个小时，但是我感觉可以继续用，查了一些资料，大家也是说可以继续用的

二、挑选单克隆

1.第二天我们就观察板子是否长起来，如果长起来，就在超净台中