实验原理

酶联免疫吸附实验（Elisa）是指用已知的抗原或者抗体吸附在固相载体表面，然后使用酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。这个技术可以用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、便捷、载体易于标准化等优点。

标本要求

1.标本采集以后需要尽快进行提取，提取按照相关的文献进行，然后提取完以后需要进快进行实验，如果不能立刻进行实验，则需要将标本放在-20℃进行保存，避免反复进行冻融。
2.不能检测含NaN3的样品，因为这个东西会抑制辣根过氧化酶（HRP）的活性。

试剂组成

30倍浓缩洗涤液
酶标试剂
酶标板
样本稀释液
显色剂A
显色剂B（黑色的那个）
终止液
标准品
标准品稀释液
封板膜
自封袋

实验步骤

所需的枪：10ul-50ul-300ul多道移液器，200ul单道移液器
1.从冰箱中取出样本，置于2-8℃中解冻30分钟以上（冻存样品不建议直接放在室温进行解冻）；
2.试剂用涡旋仪涡旋5秒，或者上下颠倒混匀（混匀不充分的情况下，会造成CV值过大）；
3.拆开酶标板，如果有拼板，拆板后需要将板按平；
4.设置我们的加样孔，标准品需要5个梯度，然后需要两个重复这样的话就是10个孔，然后需要两个空白孔，然后其他的就是样本孔（未使用的那个板条需要放进干燥袋中，然后放到2-8℃中进行保存）；

稀释标准品

5.准备5个EP管，依次编号1-5号，然后将移液器调整至150ul，然后在每个EP管中加入150ul的标准品稀释液，然后更换枪头以后在第一个Ep管中加入150ul的标准品，并用混匀仪混匀5秒。然后在1号管中吸取150ul，加入到2号管中。然后3号再吸取150ul，依次类推。

加样

6.将移液器调准50ul，就是将标准品加入到孔中，每个孔里面加入的量是50ul；
7.样本孔中，每个孔中加入40ul的样本稀释液，然后每个样本孔中需要加入10ul的样本，空白孔中不加入任何东西（注意加样时间尽量是15min中完成，以免造成前后孔反应时差）；
8.封上封板膜并轻轻摇晃酶标板；
标记项目及时间以后放入到37℃恒温箱重孵育30分钟；

洗涤

9.用量筒量取20ml的浓缩洗涤液和580ml的去离子水，分别导入一个大烧杯中混匀，用玻璃棒进行搅拌；
10.孵育结束后取出酶标板，拿一个加液槽，倒入混匀好的洗涤液，然后酶标板在吸水纸上拍干；
11.准备200ul的多道移液器，每孔中加入200ul的洗涤液，静置30秒之后弃去液体，重复洗涤、静置和弃液5次并拍干酶标板；

孵育

12.然后将酶标试剂（抗体）加入到加样槽中，每孔加入酶标试剂50ul（空白孔除外），然后封上封板膜并轻轻摇晃酶标板；
13.标记项目及时间以后放置37℃恒温想中孵育30分钟；
14.孵育结束以后取出酶标板，弃去液体，然后又是每孔加入200ul的洗涤液，静置30秒以后弃去，重复洗涤这个步骤5次，在吸水纸上轻轻拍干液体；

显色终止

15.将显色液A和显色液B分别导入到加样槽中，加入50ul的显色液A，更换枪头以后每板加入50ul的显色液B；
16.标记项目和时间以后加入到37℃恒温箱中避光孵育10分钟；
17.孵育结束以后，小心撕去封板膜（这个时候酶标板有肉眼可见的呈现梯度的色差），终止液加到加样槽中，然后每个孔中加入50ul的终止液进行终止反应（此时酶标板中的液体由蓝色转变为黄色），轻轻摇晃酶标板后待用；

测定读书

18.酶标仪检测，以空白孔调零，然后测量450nm的吸光度