一、实验目的

确保就是我们加的“药”对于细胞来说是没有害的

二、实验原理

三、实验方法及步骤

1.制备细胞悬液：取一板细胞弃去旧的培养基，加入pbs洗一下，贴壁细胞用胰酶进行消化，消化完毕后弃去胰酶，加入新的培养基将细胞吹下来，然后离心得到细胞沉淀，弃去培养基，用新的完全培养基重悬得到单细胞悬液。
2.细胞板计数：通过计数得到的细胞浓度，我们就加4000个细胞，就比如说细胞浓度是2000个/ul，那我们每个孔就加2ul的单细胞悬液，然后这个只加2ul，所以我们直接就加100ul的新的培养基到96孔板中。
3.细胞铺板贴壁：将96孔板放入培养箱中预培养24h左右（37℃, 5%CO2）。
注意：培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，造成体积不准确，从而增加误差，因此，建议最外一圈的孔只加PBS，不作为测定孔用
4.向培养板各孔中加入不同浓度的待测物质（药物、化学试剂等）放入培养箱中孵育6~96h。
5.向每孔中加入10μl CCK-8溶液（每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液，这里之前我们是100ul的培养基，所以这里是10ul的CCK8溶液），加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀（防止因CCK8试剂沾在孔壁上而带来的误差），加样的过程中尽量不要产生气泡，以免影响OD值读数。
注意：可以这么操作，减少不必要的误差，弃去原来的培养基，计算我们的孔的数量，按照（孔的数量+2）X100ul计算我们所需要的培养基的数量，还有就是加入10%的CCK8溶液，这样做的好处就是不怕不匀了。
6.将培养板放入培养箱中孵育1-4h。
7.用酶标仪测定450nm处的吸光度（OD）。

注意事项
（1）接种细胞数：针对标准96孔板，贴壁细胞的最小接种量为1000个/孔 (100μl培养基)。若为白细胞，接种量不低于2500个/孔 (100μl培养基)。若使用24孔板或6孔板，应预先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
（2）在细胞毒性实验中，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度作为空白对照。
（3）在培养箱中孵育期间，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，造成体积不准确，从而增加误差，因此，建议最外一圈的孔只加PBS，不作为测定孔用。
（4）加入待测物之后培养的具体时间6~96h要看待测物质的性质和细胞的敏感性，例如6、12、24、48h。实验时可以选择不同作用时间下进行细胞毒性检测。
（5）如果待检测物质有氧化性或还原性，在加入CCK-8之前要更换新鲜培养基，以去掉待测物质的影响。如果影响比较小或者没有影响，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
（6）正常显色时间为1-4h，可以每半小时测定一次OD值，使其OD值保持在1-2之间后固定显色时间重复实验。
（7）因为细胞种类不同，形成的formazan的量也不一样，所以如果显色不够的话，可以延长培养时间，特别是血液细胞需要较长的显色时间（5-6h）。
（8）测定波长：如果样品为高浑浊度的细胞悬液，建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm，建议选650nm。
（9）若暂时不测定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室温避光保存， 24h内测定OD值不会发生变化。
（10）新鲜的CCK-8试剂为粉红色，储存时间过长则颜色加深、效率变低，最好不使用。通常情况下CCK-8试剂在0-5℃避光条件下可保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。

关于对照：

实验组：ges1+DMEM培养基+cck8+脱落酸
对照组：ges1+DMEM培养基+cck8
空白组：DMEM培养基+cck8

细胞活力=【（OD_药-OD_空）】/【OD_无药-OD_空】X 100%