实验protocol展示
从cDNA或者质粒上面克隆某个目的基因
Takara：prime STAR Max（高保真酶）-25ul
cDNA（或者质粒）-5ul
上游引物-5ul
下游引物-5ul
无菌水-10ul
反应程序见PCR仪器上面的takala gene clone程序
shRNA寡核苷酸退火成双链
反应体系：
10ul 上游引物（引物浓度是10uM的）
10ul 下游引物（同上）
5ul 10X酶切缓冲液（这个既可以用于双酶切也可以用于退火）
25ul ddH2O
反应条件：
95℃，孵育4min，自然冷却到室温（大约需要两个小时）
退火完成的shRNA是不用进行切割的，这个已经自带酶切位点了，这个也是和基因克隆不一样的地方之一。
质粒双酶切
白鲨
反应步骤：
- 在冰上建立以下反应：（请注意：酶最后加入反应）
| 组分 | 反应体系 |
|---|---|
| 质粒DNA | 5ug（说明书是1ug，但是我切的是5ug的量） |
| 10× RapidCut Buffer | 5ul |
| Restriction Enzyme AgeI | Iul |
| Restriction Enzyme EcoRI | 1ul |
| Nuclease-free Water | To 50 ul |
2.缓慢吸打混匀反应液，并瞬间离心。
3.37℃温育5-15分钟（可以过夜酶切，不会出现星号活性），这个条件我就自己调整为30min吧。
4.80℃温育20分钟热失活。
Takala
下面这个是塔卡拉的快切酶的反应。
| 组分 | 反应体系 |
|---|---|
| BamHI | 2ul |
| XbaI | 2ul |
| 质粒 | 5ug的量 |
| 10X buffer | 5ul |
| 水 | 补足到50ul |
反应时间30℃，30min。
质粒双酶切以后进行割胶回收
目的片段和载体连接
连接体系：
1ul退火的oligo寡核苷酸
2ul plko.1（要看是否用AgeI/EcoRI切开载体）
1ul T4 DNA连接酶
1ul 10XNEB T4 DNA连接酶缓冲液
5ul ddH2O
反应条件：
10ul的体系，22℃ 4h或者16小时过夜反应。
感受态转化
①37℃预热固体LB培养基；
②取出一管（100ul）感受态，冰上融化，连接体系同时冰浴；
③加入5ul的连接体系或者1ul的质粒，轻轻弹匀以后放置在冰上30min；
④42℃金属浴热激90秒，迅速放回冰上，静置2——3分钟；
⑤将上述液体转入900ul的SOC培养基（或者就正常的没有加抗性的LB培养基），摇床37℃，培养1h，转化质粒培养30min；
⑥12000rpm，离心10s，弃去上清加入1ml的无菌水重悬细菌；
⑦12000rpm，留取100ul上清重悬细菌，并涂板，37℃，培养13——16小时。
⑥——⑦步骤我们是直接8000rpm，离心10s，然后就留100ul的LB培养基重悬细菌，然后就涂板了。