011 小鼠及细胞内Aba含量检测

实验protocol展示

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小鼠中ABA含量的测定

为了测定血清中的ABA水平，从心室收集血液，首先在室温下孵育30分钟以使血凝块，然后以1700g离心10分钟以将血清从全血中分离出来。接下来，将 200 μL 小鼠血清加入到 800 μL 甲醇中。将混合物涡旋并在-70°C的超速冷冻室中孵育过夜。将混合物在4°C下以10 600 g进一步离心15 min，并使用SpeedVac蒸发上清液。将干燥的残留物重悬于1 mL 50 ： 50水：环己烷溶液中。通过在10 600 g离心5 min分离相。接下来，将 250 μL 5% 三氯乙酸加入收集的水相中，并通过涡旋混合。将混合物与 500 μL 乙酸乙酯分开 3 次，收集有机层并使用 SpeedVac 蒸发。将干燥的残留物重悬于50 μL超纯水中，并使用AcroPrep Advance 96滤板0.2 μm Supor（Pall Life Sciences，Port Washington，NY，USA）过滤，然后通过LC-MS/MS进行色谱分离和定量。
参考文献：Engineering a highly sensitive biosensor for abscisic acid in mammalian cells设计一种高灵敏度的生物传感器，用于哺乳动物细胞中的脱落酸

生物传感器检测细胞中的ABA的含量

1.文献内容：脱落酸 （ABA） 是一种在植物、细菌、真菌和动物中保守的信号分子。最近，ABA因其药理活性及其作为慢性阻塞性肺疾病和神经胶质瘤严重程度的生物标志物的潜力而受到关注。这促使人们开发一种可靠、灵敏、快速且具有成本效益的方法来量化哺乳动物细胞和组织中的 ABA 水平。先前描述的基于植物 ABA 受体 PYL1 和辅助受体 ABI1 之间 ABA 依赖性相互作用的 ABA 生物传感器系统对于哺乳动物中看到的低 ABA 水平不够敏感。因此，我们通过用其他高亲和力植物 PYL 蛋白替换 PYL1 来优化该系统。使用 PYL8 受体设计的优化生物传感器系统能够在HEK293T细胞中定量低浓度的 ABA
2.参考文献：Engineering a highly sensitive biosensor for abscisic acid in mammalian cells设计一种高灵敏度的生物传感器，用于哺乳动物细胞中的脱落酸

Elisa检测细胞中的ABA的含量

暂无

通过HPLC检测细胞中的ABA的含量

1.文献内容：将 50% 血细胞比容的 50 μl 红细胞等分试样在 50 μl HBSS 中与 0.025、0.25、2.5、10 和 25 mm ABA 重复孵育 30 秒。用1.6ml冰冷的HBSS洗涤细胞两次，重悬于100μlH2O中，用4体积的冰冷丙酮提取并储存在-20°C。 将提取物以 16,000 × g 离心 5 分钟，从上清液中除去丙酮后，将水提取物在 pH 2.6 下用三氟乙酸酸化并用乙醚提取。在氮通量下除去乙醚后，将提取物重新溶解在H2 O中，并使用Hewlett-Packard HP1200仪器进行HPLC分析。色谱柱为Atlantis C18（3.9 × 150 mm，5 μm，Waters，米兰，意大利）：溶剂A为H2O，含有0.01%（v/v）乙酸，溶剂B为100%乙腈。溶剂程序为线性梯度（流速为0.8ml / min），从100%溶剂A开始，在30分钟内增加到100%溶剂B。 使用设置为260nm的HP 1040二极管阵列分光光度检测器检测ABA：ABA在17.5分钟时洗脱。将样品ABA的峰面积与计算机存储的标准品的峰面积进行比较，从而可以鉴定和定量激素。
2.由此开发的实验方法

Note
1.先用PBS洗涤细胞两次，然后用胰酶将细胞消化下来，1500g离心3分钟得到细胞沉淀；
2.弃去胰酶，将细胞沉淀重悬于100ul的up水中，用4倍体积的冰冷的丙酮进行提取，提取液储存在-20℃中；
3.将提取物在 16,000 × g 下离心 5 分钟，从上清液中除去丙酮后，用三氟乙酸将水提取物酸化至 pH 2.6，并用与水相同体积的乙醚提取（但是现在我没有三氟乙酸，所以我就想用盐酸替代）；
4.在氮通量下除去乙醚后，将提取物重新溶解在甲醇中，所得即为含有ABA的样品液。

各种试剂在整个过程中的作用

1. 丙酮 (Acetone)

  • 作用：丙酮是一种强极性有机溶剂，用于从红细胞中提取ABA。
  • 机理：丙酮可以有效地破坏细胞膜，使细胞内部的成分释放出来，包括ABA。因为ABA是较为疏水的分子，丙酮能够溶解并提取它。丙酮提取后，样品通常需要进行冷冻保存，防止ABA降解。

2. 三氟乙酸 (Trifluoroacetic Acid, TFA)

  • 作用：TFA是一种强酸，用于酸化水相中的ABA提取物。
  • 机理：TFA将提取物的pH值降低到2.6左右，促使ABA分子保持非离子化状态。在这种酸性条件下，ABA更容易从水相转移到有机溶剂（如乙醚）中，因为非离子化的ABA分子在有机溶剂中具有更高的溶解度。酸化还可以防止某些潜在的副反应，如ABA的降解。

3. 乙醚 (Diethyl Ether)

  • 作用：乙醚是一种有机溶剂，用于从酸化的水相中进一步萃取ABA。
  • 机理：在酸化的条件下，ABA以非离子化形式存在于水相中。乙醚是一种疏水性有机溶剂，它可以选择性地从水相中萃取出ABA等疏水性化合物。这一过程利用了ABA在乙醚中的高溶解性，使得ABA能够从水相转移到乙醚相，从而实现其纯化和浓缩。