包病毒（全程完全培养基，除了加质粒那些是基础培养基）

1.细胞转染前一天，将293T细胞按合适密度接种于10cm的细胞培养皿中，确保细胞第二天的密度达到60%——70% 左右。
2.第二天转染的时候将病毒包装质粒PsPAX2，PMD2G和构建好的shRNA质粒分别取9ug，3ug，12ug，加入500ul转染专用培养基中（如果没有的话，就用不含血清的培养基就行了）。

SCR:901.5
PSPAX2:1380.5
PMD2G:1216.3
SHLANCL2:919.6

PSPAX2需要取6.52ul
PMD2G需要取2.47ul
SCR需要取13.31ul
shLANCL2需要取13.05ul

3.然后取72ugPEI转染试剂（这个只需要加0.8ul即可）加入500ul转染专用培养基，轻轻吹打混匀。
4.5分钟后将两种液体颠倒混匀，室温静置孵育20min，然后加入细胞培养基（这个细胞培养基用的就是basic base就行了）中，轻轻混匀。
5.4—6小时以后更换培养基，换液，将原来的培养基换成新的完全培养基高糖DMEM。换液的目的是为了除去转染试剂，因为PEI是有毒的。

病毒包装中

在包病毒的过程中，我们可以去观看一下细胞，可以很明显看到细胞就是从原来之前的星状逐渐变成圆圆的样子，这个是我观察的效果，小红书上面也是这么写的。

收病毒

1.待病毒包装48小时后，收取病毒，病毒存于培养基中。
2.将培养基收集至15ml离心管中，700g，5min离心除去死细胞，离心的同时用PBS洗超滤管（洗三次）。
3.取离心后的培养基，吸上清到超滤管，每管中加入10ml，3551g，9min，4℃，检查是否浓缩到1ml，如果没有就需要再离心1min。
离心的同时准备1.5ml的EP管，取上清，吸起来的时候要进行吹吸，因为病毒颗粒是沉降在底部的。
1管超滤管对应1管1.5ml的EP管，超滤管要始终保持湿润，所以用完之后需要加一些PBS。

用完之后洗超滤管

0.2m的氢氧化钠 20—30min，然后用miliQ洗三次，然后是20%乙醇，用之前还需要用PBS洗三次。

病毒感染细胞（用完全培养基就行）

收完病毒接着感染细胞最佳，短期可以保存在4℃，长期保存在-80℃，用病毒前定容到1ml（收集好的病毒EP管，需要加DMEM培养基补足到1ml，这个培养基用完全培养基就行不会影响感染效率的，记得吹打混匀一下。然后500ul分别加到两个板细胞中在这里即指12孔），5次吹吸混匀。
1.感染前一天接种于12孔板，使得感染细胞当天细胞密度约50%，6孔板等同于500ul的细胞悬液；
2.感染时去掉培养基，加入500ul新鲜培养基和500ul病毒液；
3.病毒感染24小时需要换液，去病毒；此时12孔板的细胞已经长满，将其消化并按需接种至新的细胞培养基中；这个时候是加入病毒24小时
4.换液24小时后，加入2ug/ml的嘌呤霉素用以筛选未被感染的细胞；这个时候是加入病毒后48小时
5.一般取96小时收取细胞用以检测敲低效率。这个时候是加入病毒后96小时