030 核质分离

核质分离的实验原理

核质分离的实验原理主要基于细胞膜与核膜的结构差异，以及不同细胞组分的物理性质（如密度、沉降速度等），通过分步裂解和离心技术实现细胞质与细胞核组分的分离。
细胞膜裂解：使用低渗缓冲液（如含低浓度去垢剂的蔗糖溶液）使细胞膨胀，破坏细胞膜，释放细胞质内容物。去垢剂（如Nonidet P-40或Triton X-100）可溶解细胞膜脂质双层，但不足以破坏核膜。
核膜保留与核分离：细胞核的核膜结构较为坚韧，需通过高速离心或高盐缓冲液进一步处理才能释放核内物质。
样品在buffer作用下细胞破裂，释放细胞浆蛋白及其它蛋白，然后通过离心后得到的沉淀中含有细胞核，然后在通过高盐buffer得到核蛋白。

我的母液

细胞浆蛋白抽提Buffer

Tris-Hcl（Ph7.5）--10mM（这个先用1M的PH为7的Tris-Hcl进行Ph调节，让其为7.5，然后就取400ul）
Nacl----------------10mM（0.2ml的2M的Nacl母液）
Mgcl2---------------3mM（1.2ml的100mM的Mgcl2的母液）
NP40----------------0.5%（2ml的10%的NP40母液）
甘油-----------------10%（这个已经灭菌好了在细胞房，这个需要4ml的灭菌甘油母液）

Milliq定容到40ml。

  • 配置2M的Nacl，这个灭菌以后使用；

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  • 配置100mM的Mgcl2

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  • 1M kcl的配置

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4℃保存，使用之前加入PIC至1X，PMSF需要加至1mM，然后就是RI（这个就是RNA酶抑制剂）需要加100u/ml。

细胞核抽提蛋白buffer

Tris-Hcl（Ph7.0）--------10mM（这个我有一瓶是Ph7.0的，所以直接就是取400ul的体积就行）
EDTA---------------------4mM（这个太难溶解了，所以直接称量，40ml的体积需要称量0.06g的EDTA二钠二水）
Nacl----------------------0.3M（6ml的浓度为2M的Nacl母液）
ureA----------------------1M（这个需要5ml的8M的尿素母液）
NP40----------------------1%（这个需要4ml的10%的NP40母液）

Milliq定容到40ml。

8M的尿素母液（不灭菌）
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0.5M的EDTA母液（不灭菌）
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实验步骤

具体步骤：以6孔板的一个孔的293T细胞为例：
1.0.25%胰酶消化细胞，快速终止，（更加推荐的是用细胞刮刀进行收集），收集至EP管，离心，PBS洗涤沉淀2次，尽可能吸弃上清。
2.冰上预冷好低渗buffer（含蛋白酶抑制剂+磷酸酶抑制剂），向管内加入100uLbuffer（这个加的量就是细胞沉淀的10倍）（这个相对是106个细胞而言，因为这个细胞量沉淀的体积大概就是10ul，具体细胞量的体积可以用移液器来衡量），吹打重悬细胞，冰上静置10min，使细胞涨破。【然后我10cm板的THP-1细胞沉淀的体积是100ul，正常来说应该加1ml，但是我加的是600ul）
3.剧烈涡旋10s，4℃，4000rpm离心10min，上清即为细胞浆蛋白；
4.将上清转移到新的EP管中，不要吸到沉淀！！！上清即为细胞质，可直接根据体积加loading煮样。
5.加入细胞浆lysis buffer重悬细胞核沉淀，再次4°℃4000rpm离心5min，以去除残留的细胞质。如果不放心，可以多洗一遍。另转速和时间可调，只需把核离下来就行。
6.清洗后尽量吸弃上清，根据沉淀量加入适量的RIPA（含抑制剂）（这个我一般加细胞浆lysis的一半体积，也就是我这里加300ul），吹打/涡旋混匀，冰上裂解。（这里加的是100μL，冰上10min，期间涡旋混匀2-3次）。
7.14000rpm4℃离心15min，上清即为核蛋白组分。（若初次做如果沉淀较多，可能裂解不够充分，可考虑延长冰上时间或超声处理。）转移至新的EP管中，根据体积加loading煮样即完成了样本制备。